CRISPR/Cas9基因编辑技术（包含Base editor）专题研讨会

2021年10月23～24日    网络精讲班

莫速乎科研会议平台主办 

    基因编辑技术指能够让人类对多个物种内的目标基因进行“精确编辑”，实现对特定DNA片段的删除、插入、定点突变等。与传统的TALEN和ZFN基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9技术自问世以来，以其操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，成为当下科研工作者的新宠儿。目前该技术已广泛应用于人、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、猪、水稻、小麦和拟南芥等动植物（细胞）以及细菌等微生物的基因组靶向改造，并已在功能基因组研究、疾病防治、动植物育种、动物疾病模型开发、基因治疗等领域展现出巨大的应用前景。

大量从事医学和生命科学的研究者，都将会在自身的研究领域中用到CRISPR/Cas9基因编辑技术，但在实际操作中，由于各种原因常常遭遇技术瓶颈，因而无法顺利地达成实验目标。本次研讨会将深入系统的讲解CRISPR/Cas9基因编辑工具原理，操作流程，理论结合实践，同时讲解实验操作容易遇到的问题及注意事项、解决方法，将让大家详细了解到具体如何利用CRISPR/Cas9技术构建基因修饰动物等。本次学习班将组建微信群与老师深入交流探讨，帮助解决后续实验过程中遇到的技术及理论问题。可提前准备好自己科研中遇到的问题，通过现场及后续的交流探讨，全面掌握CRISPR/Cas9技术应用的方法及技巧，避开科研路上的弯路和陷阱，轻松成为科研达人。

本次研讨会主办单位：

莫速乎科研教育（上海莫速乎教育投资有限公司） 上海荆麦信息科技中心

主讲专家：

主讲专家来自中国科学院，先后参与并承担973、863、国家自然基金课题及转基因重大专项课题。研究领域为基因组编辑、体细胞核移植、疾病模型的建立以及胚胎发育过程中表观遗传学研究等。有丰富的理论和实际研究经验。学员通过与专家直接交流，能够分享到这些顶尖学术机构的研究经验和实验设计的思路。学员通过集中专题学习后能够扩展思路，在研究技术方面领悟更多。

课程目标：

1、     掌握基因打靶与基因编辑技术(ZNF,TALENs,CRISPR/Cas9)，能够设计sgRNA靶点，构建CRISPR/Cas9质粒，用于基因敲除和敲入。

2、     掌握CRISPR/Cas9质粒转染方法, 阳性细胞克隆筛选方法体系，基因编辑细胞系的建立，基因修饰情况分析方法。

3、     掌握CRISPR/Cas9脱靶产生的原因，脱靶检测方法，降低脱靶问题的方法

4、     掌握CRISPR/Cas9的实际应用，对构建基因修饰小鼠和基因修饰大动物（猪）有较深入了解。

5、     掌握新基因编辑工具，如：Cpf1, C2C2, base editing等。

6、     掌握基因编辑研究领域前沿进展，基因编辑工具的拓展应用、临床应用等，形成利用基因编辑工具结合自己研究内容等科学思维。

课程安排：(具体课程进度根据实际反馈情况进行适当调整)

课程安排：(具体课程进度根据实际反馈情况进行适当调整)

第一天上午8:30-11:30

一、基因编辑技术概述

1、转基因与基因打靶技术

2、基因敲除与基因敲入技术

3、基因编辑技术的开创者——ZFNs

4、细胞基因组DNA的修复机制

5、第二代基因编辑技术——TALENs

6、第三代基因编辑技术——CRISPR/Cas9

7、基因编辑技术有多火？

二、CRISPR/Cas9基因组编辑技术原理

1、CRISPR/Cas系统

  1.1、CRISPR/Cas系统的发现

  1.2、CRISPR/Cas系统的组成

  1.3、CRISPR/Cas系统的工作原理

2、CRISPR/Cas9技术的发展及其应用

  2.1、CRISPR/Cas9技术的建立

  2.2、CRISPR/Cas9技术的应用

  2.3、CRISPR/Cas9技术的脱靶问题

三、Cas蛋白的选择

1、Cas蛋白的选择 

  1.1、Cas蛋白的分类

  1.2、三种应用最广泛的Cas蛋白

1.3、Cas9蛋白的结构特点简介

1.4、Cas9蛋白与PAM序列   

  1.5、Cas9的密码子优化与NLS

  1.6、如何选择Cas蛋白？

2、Cas蛋白资源查询

3、以上内容相关实验的注意事项、实验技巧、实验结果讲解

第一天下午13:30-17:00

四、CRISPR（gRNA）的设计与制备

1、设计gRNA之前需要确定的事（编辑策略的选择、基因结构分析及查询方法）

2、RNA的设计（在线互动设计演练）

3、gRNA表达载体的构建

3.1、gRNA的体外表达（RNP）

3.2、gRNA细胞表达载体构建

3.3、常见gRNA/Cas蛋白表达载体

4、以上内容相关实验的注意事项、实验技巧、实验结果讲解

五、gRNA活性检测

1、  Indel突变检测的基本策略

1.1、错配内切酶法（EMC）

1.2、TIDE/ICE分析法

1.3、TA克隆法

1.4、酶切片段长度多态性法（RFLP）

1.5、其他方法

2、基于胚胎的活性验证方法

3、以上内容相关实验的注意事项、实验技巧、实验protocol、实验结果讲解

六、基因编辑工具Cas12a(Cpf1)

1、Cpf1的发现

2、Cpf1与Cas9的区别

3、Cpf1的应用案例

4、Cpf1可同时介导多个基因的编辑

第二天上午8:30-11:30

七、利用CRISPR/Cas9技术创建基因组编辑细胞系

1、目标基因的基因组组成分析

  1.1 目标基因在目的细胞中的表达情况

  1.2 如何确定基因的重要的功能域

  1.3 可变剪接及多转录本

2、基因组编辑策略设计

  2.1基因敲除

  2.2基因敲入

  2.3定点突变

  2.4大片段删除

3、sgRNA的设计与活性验证

  3.1 如何选择位置合适的gRNA？

4、用于基因敲入的供体DNA的设计

  4.1 Donor DNA的形式

  4.2 使用ssODN作为Donor

  4.3 设计ssODN的要点

  4.4 插入位点与DSB位点一致的情况

  4.5 插入位点与DSB位点不一致的情况

5、质粒（和/或供体）导入细胞系的方法（脂质体转染，电转，病毒转导）

6、阳性克隆筛选

  6.1 抗生素筛选（Protocol）

  6.2 挑单细胞克隆（Protocol）

  6.3 基因型鉴定

6.4 根据打靶效率估算需要筛选的克隆数量

  6.5 有限稀释法稀释细胞的流程（Protocol）

  6.6 基因型鉴定

7、基因组编辑细胞系的建立

8、提高基因敲入（同源重组）效率的策略

9、以上内容相关实验的注意事项、实验技巧、实验protocol、实验结果讲解

八、CRISPR/Cas系统介导的基因编辑案例介绍

1、CRISPR常规工作流程

2、Knock-out案例1

3、Knock-out案例2

4、Knock-in案例

第二天下午13:30-17:00

九、利用CRISPR技术创建基因组编辑动物

1、CRISPR/Cas方法与传统方法的比较

2、基因编辑动物制备流程

3、通过显微注射法制备基因编辑小鼠

3.1、小鼠的超排和显微注射

3.2、胚胎移植和基因型鉴定

3.3、显微注射法获得的基因编辑动物的鉴定

4、通过体细胞克隆法制备基因编辑动物

  4.1、供体细胞分离、培养

  4.2、供体细胞的基因编辑

  4.3、体细胞核移植操作

  4.4、胚胎移植

  4.5、基因编辑个体的鉴定和扩繁

十、CRISPR转录抑制/转录激活以及CRISPR screen

1、dCas9的特征简介

2、运用CRISPR技术进行转录调控的原理

3、CRISPR转录抑制/转录激活技术及优化

4、CRISPRoff

5、CRISPR screen及CRISPRa/i screen（高通量筛选）

十一、单碱基编辑与单碱基编辑器（CBE、ABE、PE）

1、  单碱基编辑器的原理

2、  单碱基编辑器的优化

3、  先导编辑技术原理及其应用

十二、基因编辑技术的脱靶问题

1、  脱靶产生的原因

2、  基因编辑工具的脱靶风险

3、  脱靶检测方法

4、  如何降低脱靶？

十三、Cas12和Cas13蛋白及其应用

1、  Cas12和Cas13与Cas9的差异

2、  Cas13特点及其在核酸检测中的应用

3、  SHERLOCK及DETECTR系统原理

十四、基因编辑技术相关资源

介绍CRISPR/Cas系统以及基因编辑相关的质粒、gRNA、文库、细胞、Protocol以及技术blog等资源。

会务信息

时间地点：

2021/10/23-24   网络精讲班

3200元/人  注册费包含网络直播平台费、专家讲课费及视频课程的费用。注册费用

主办单位：莫速乎教育（上海莫速乎教育投资有限公司）、上海荆麦信息科技中心