第二天 周六 上午 9:00-12:00

内容

1, px330质粒系统介绍。

2，sgRNA oligos模板退火方案。

3，退火gRNA与线性化CRISPR/Cas9载体连接详细方案。

4，连接产物转化到大肠杆菌（DH5α）。

5，转化产物涂板培养。

6，鉴定插入oligo后的基因编辑质粒ps330质粒体系。

7，构建同时敲除两个基因的质粒体系。

8，如何构建CRISPR/Cpf1质粒体系。

9，CRISPR/Cpf1质粒体系鉴定。

第二天周六下午 13:00-18:00

1，Cas9的多功能系统（如Cut, Nick, Activate, dCas9-FokI）的详细介绍。

2，利用CRISPR/Cas9构建基因修饰小鼠方法介绍和实际操作方案

3，CRISPR/Cas9相关基因修饰小鼠模型介绍和操作方案

4，利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大动物（猪、猴）方法介绍和实际操作方案

5，CRISPR/Cas9与基因修饰大动物模型介绍和详细操作方案

专题：利用CRISPR/Cas9技术编辑动物细胞系

1， CRISPR/Cas9质粒细胞转染方法

2， 阳性细胞克隆筛选

3， 基因编辑细胞系的建立

4， 基因修饰情况分析方法

第三天 周日  上午9:00-12:00

1， CRISPR/Cas9重组子细菌克隆挑取，扩大化培养，鉴定，

2， 基因修饰基因组DNA模板（转染CRISPR/Cas9到动物细胞后提取DNA）制备

3， 目的靶基因的基因组DNA片段的PCR扩增，电泳检测PCR产物

4， PCR产物退火变性，T7E1酶切，电泳鉴定基因修饰情况

专题：利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除或敲入小鼠

1，基因编辑工具CRISPR/Cas9基本背景介绍

2，sgRNA设计及其功能验证

3，小鼠受精卵分离和培养

4，CRISPR/Cas9系统显微注射到小鼠受精卵

5，受精卵显微注射后回输到代孕母鼠体内

6，PCR和T7E1分析和鉴定基因敲除小鼠（Founder）

7，基因敲除小鼠基因敲除情况分析

8，CRISPR/Cas9构建基因敲除小鼠详细实验流程归纳和总结

第三天 周日 下午13:00-15:00

专题：实验结果的点评与讨论

1， CRISPR/Cas9载体构建讨论

2， 目的靶基因的基因组DNA片段的PCR扩增，电泳检测PCR产物结果讨论

3， PCR产物T7E1酶切，电泳鉴定基因修饰情况结果讨论

4， Sanger测序鉴定基因编辑结果

1） CRISPR/Cas9质粒阳性转化子测序结果确认

2） Sanger测序阅读基因编辑情况

3） 如何从测序色谱图中阅读靶向突变等位基因型

专题：利用CRISPR/Cas9技术构建基因修饰大型动物（猪）

1， 利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大型动物（猪）流程

2， 基因修饰大型动物优势

3， 利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大动物（猪）模型介绍

专题：CRISPR/Cas9脱靶问题分析

1， 脱靶产生的原因

2， 脱靶检测方法

3， 降低脱靶问题的方法

专题：基因编辑工具拓展

1， CRISPR/Cas9技术的发展与应用

2， 新基因编辑工具Cpf1，C2C2的用法与比较

3， 基因编辑工具的伦理问题

4， 基因编辑工具的应用拓展。

5， 根据学员的研究内容，详细答疑如何使用基因编辑工具。

第七期上海CRISPR/Cas9基因编辑学习班时间，地点